Producción de Nitrogenasa a partir de una bacteria fijadora de nitrógeno, en fermentación sumergida bajo operación batch, una alternativa ambiental para el sector agrícola

Abstract

Con este proyecto se propone un procedimiento para la producción del enzima Nitrogenasa a partir de una bacteria fijadora de nitrógeno la cual posee este enzima que es el responsable de la reducción del nitrógeno disponible a nitrógenos asimilables para las plantas. El primer paso del procedimiento fue aislar la bacteria a partir de un suelo forestal con ayuda de un medio libre de nitrógeno llamado Medio Burk, para luego identificarla morfológica, bioquímica y molecularmente. Los resultados moleculares arrojaron que la bacteria aislada fue Brevundimonas sp., la cual tiene las características de fijación del nitrógeno por medio del enzima nitrogenasa. Seguido se determinó la mejor concentración para los dos componentes del medio Burk encargados de ayudar a expresar el enzima en este caso Na2SO4 y Na2MoO4. Para hallar la concentración que mejor expresará el enzima se modificó las concentraciones en 5 ensayos a los que se les llamo pre inóculos, se llevaron a diferentes rpm de agitación con temperatura de 30ºC, el seguimiento de su crecimiento se evaluó midiendo su absorbancia a 540 nm de 25 a 27 horas, lo cual permitió conocer su velocidad de crecimiento y tiempos de duplicación, en donde se escogió el comportamiento de una curva de crecimiento bacteriano que cumpliera con las fases de la curva de crecimiento bacteriano. Teniendo identificado las concentraciones que mejor expresaron el enzima, se llevaron al medio Burk para ejecutar la fermentación en un biorreactor de 2 litros fabricado en acero inoxidable de 16” el cual está diseñado para trabajar con un multi parámetros llamado GLX proporcionado por la Universidad. El crecimiento de la bacteria en fermentación sumergida bajo operación batch duro tres días, monitoreando parámetros físicos como pH, temperatura, oxígeno y dióxido de carbono, y conteo de las unidades formadoras de colonias (UFC) como parámetro microbiológico. Terminado los tres días se recuperó la biomasa (Bacteria y enzima expresada) por medio de centrifugación a 6000 rpm por 15 minutos y se contabilizo el enzima total por medio de una curva de proteína teniendo como patrón la gelatina. Esta concentración fue de 1,62 mg/ml. Concluyendo que por cada mililitro de la biomasa recuperada se encuentra 1,62 mg de enzima total.